乙醇是一种常见的成瘾性物质。据世界卫生组织报道，2016年有300多万人因有害使用乙醇而死亡[1]。世界卫生组织的国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)早已将乙醇和其代谢产物乙醛列为人类一类致癌物质[2]。遗传因素在乙醇消耗和成瘾过程中起重要作用。研究较为广泛并且已证实与饮酒行为相关的是ADH2和ALDH2。有研究表示，细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)的c2等位基因、五羟色胺1B(5HT1B)受体基因以及脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，FAAH)C385A位点基因与饮酒行为及乙醇依赖有关[3～5]。本研究选取了上述5种乙醇代谢相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为研究目标基因，旨在了解乙醇代谢基因在云南省哈尼族、彝族和汉族人群中的分布情况，以及探讨不同民族人群之间的乙醇代谢基因遗传差异与饮酒行为的关系。

对象与方法

1.对象：分别于2016年11月和2019年7月开展两次调查，抽取居住在云南省无直接血缘关系的哈尼族个体268例(男性104例，女性164例)、彝族个体287例(男性176例，女性111例)和汉族个体88例(男性39例，女性49例)，年龄15～87岁，所有研究对象均签署知情同意书。

2.样本DNA提取：在取得调查对象知情同意的前提下，抽取其静脉血5ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝。基因组DNA采用北京工程技术天根有限公司合成的血液基因组DNA提取系统试剂盒提取。

3.位点信息及引物序列：引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 位点信息及引物序列基因SNP引物序列(5′→3′)ADH2rs上游引物:ATCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTC下游引物:CTCCAACACTCTCCACGATGCALDH2rs671上游引物:TGGAGCCCAGTCACCCTTTG下游引物:AGACCCTCAAGCCCCAACAGCYP2E1rs上游引物:AAACCAGAGGGAAGCAAAGGC下游引物:CTCTTGACAATTTATTAGCCACATAAGC5HT1BA161Trs上游引物:GGAGAGGAACAACCACAGAC下游引物:CCAGTTGATAGTTCCGTGAGTTFAAHC385Ars上游引物:GTGAACAAAGGGACCAACTG下游引物:CACAGGGACGCCATAGAG

4.多重PCR扩增及产物纯化：将合成好的引物用1×TE溶解到浓度为10pmol/μl，将同一种基因的引物加到一起，混匀，离心。配制PCR体系：DNA 1-2μl，2×PCR mix 7.5μl，混合引物2μl，H2O补至15μl；将配制的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2μl DNA样品，离心，上PCR仪。扩增条件：95℃预变性3min，35个循环(94℃15s，55℃15s，72℃30s)，72℃延伸3min。为了去除反应产物中的剩余引物和脱氧核糖核苷三磷酸，PCR扩增后取3μl PCR产物用ExoⅠ和FastAP纯化。PCR产物3μl，ExoⅠ 0.2μl，FastAP 0.8μl，ExoⅠ buffer 0.7μl，H2O补至7μl。37℃ 15min，80℃ 15min，纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。延伸体系为PCR产物2μl，Snapshot Mix试剂1μl，延伸引物，1μl，水补至6μl，取1μl延伸产物，加10μl上样Hidi，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。

5.相关定义：饮酒：指曾喝过高度白酒(≥42°，一般55°)超过25ml，或低度白酒(<42°，一般38°)超过35ml，或葡萄酒超过100ml，或米酒(13°左右)超过100ml，或啤酒(一般3.3°)超过400ml。饮酒程度：饮酒程度按照世界卫生组织《国际酒精消费及危害监测指南》进行分类[6]：低水平饮酒：男性每天平均饮酒量<41g，女性每天平均饮酒量<21g；危险饮酒：男性每天平均饮酒量≥41g且<61g，女性每天平均饮酒量≥21g且<41g；有害饮酒：男性每天平均饮酒量≥61g，女性每天平均饮酒量≥41g。饮酒障碍筛查量表(alcohol use disorders identification test，AUDIT)评分：得分≥8分为有害饮酒，女性及年龄>65岁人群≥7分为有害饮酒。脸红反应评分：脸红反应是指饮酒者饮酒后脸上或身上皮肤发红或者起疹子。脸红反应评分包括以下4个维度(饮酒后出现脸红反应的频率)：从未或很少(0分)、有时(1分)、大部分时候(2分)、总是(3分)。ADH2-rs等位基因T和C文中分别用ADH2*1、ADH2*2表示。ALDH2-rs671等位基因G和A文中分别用ALDH2*1、ALDH2*2表示。

6.统计学方法：采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行统计分析，采用χ2检验和Fisher精确检验比较不同特征人群的基因型频率和等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验，采用Wilcoxon秩和检验比较不同基因型的脸红反应得分，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

平衡检验：5种乙醇代谢基因的观察值和理论值吻合程度较好，符合Hardy-Weinberg平衡定律(哈尼族：ADH2χ2=2.739、ALDH2χ2=0.434、CYP2E1χ2=1.281、5HT1Bχ2=11.069、FAAHχ2=0.869；彝族：ADH2χ2=0.218、ALDH2χ2=2.414、CYP2E1χ2=0.853、5HT1Bχ2=0.883、FAAHχ2=0.076；汉族：ADH2χ2=0.148、ALDH2χ2=1.145、CYP2E1χ2=0.731、5HT1Bχ2=0.012、FAAHχ2=0.642；P均>0.05)，样本具有群体代表性。